Evaluación de la incidencia de tetrodotoxina en moluscos bivalvos asociada a la presencia de vibrio spp. en las rías gallegas

Resumo

Con el cambio global actual, el calentamiento de los océanos asociado al cambio climático y la globalización económica y comercial, los ecosistemas marinos se han visto afectados. Estos procesos han favorecido la existencia de cambios en la distribución de especies que pueden conllevar la aparición de nuevos riesgos alimentarios al traer consigo la aparición de nuevos contaminantes de origen natural a zonas donde no se había descrito con anterioridad. En este contexto, la aparición de tetrodotoxina en distintas zonas costeras europeas, como Grecia, Reino Unido o Países Bajos, ha provocado que la European Food Safety Authority (EFSA) haya considerado que el riesgo para la salud publica provocado por esta toxina deba ser evaluado, publicando en 2017 una opinión científica al respecto, donde se demanda la necesidad de datos de ocurrencia. Respondiendo a dicha demanda, se plantea esta Tesis Doctoral, la cual tiene como un objetivo principal la búsqueda de datos de ocurrencia en las Rías Gallegas, las cuales tienen especial importancia dado su impacto socioeconómico, siendo estas, una de las principales productoras de mejillón a nivel mundial. Otro de los objetivos de esta Tesis ha sido la búsqueda de la posible conexión entre tetrodotoxina y bacterias del género Vibrio, uno de los principales sospechosos de ser productor de dicha toxina. Para ello se realizaron muestreos en diferentes puntos de las Rías de Arousa, Pontevedra y Vigo, llevando a cabo un análisis microbiológico de las muestras recolectadas, seguido de un screening de citotoxicidad usando células de neuroblastoma de ratón. Para la confirmación de la citotoxicidad se empleó la cromatografía de líquidos de interacción hidrofílica acoplada a espectrometría de masas (HILIC-LC-MS/MS). En cuanto a la implementación del ensayo de citotoxicidad con células N2a, se propuso la revisión y optimización de varios parámetros que afectan de manera directa a la sensibilidad, especificidad y fiabilidad del ensayo, como son: concentración de Ouabaína y Veratridina, tiempo de exposición de las células o efectos tóxicos inespecíficos. Del mismo modo, se evaluó el método HILIC-LC-MS/MS usado en el estudio, revisando la selectividad, la calibración, el efecto matriz, los límites de detección y cuantificación, la recuperación, etc. Un total de 2.129 muestras fueron evaluadas, de las cuales se detectó Vibrio spp. en un 26 %, se encontraron 10 muestras con citotoxicidad positiva y 4 donde se confirmaba la presencia de TTX. Por tanto, la combinación de estas dos herramientas permitió identificar muestras contaminadas con TTX. Sin embargo, la falta de materiales de referencia para sus análogos, dejaba varias incógnitas en cuanto a la existencia de muestras con una respuesta citotóxica positiva, pero sin confirmación de la presencia de TTX mediante HILIC-LC-MS/MS. En esta línea, la optimización y el uso de un fraccionamiento cromatográfico junto al ensayo de citotoxicidad y el método HILIC-LC-MS/MS, permitió identificar posibles análogos de TTX como responsables de la citotoxicidad. Por tanto, el uso del ensayo de citotoxicidad combinado con el fraccionamiento cromatográfico y el método HILIC-LC-MS/MS, permitieron disponer de una herramienta muy valiosa para el estudio de muestras contaminadas por TTX y análogos de la misma.